Ottimizzazione del metodo di coltura dei precursori melanocitici da follicoli piliferi e loro attivazione con 1,25-diidrossivitamina D3
I melanociti nelle zone di ripigmentazione della vitiligine derivano principalmente dai precursori melanocitari (MPs) presenti nella guaina esterna della radice (ORS) dei follicoli piliferi.
I metodi utilizzati per ottenere gli MPs sono ancora instabili e le cellule in coltura possono produrre melanina: questi fattori diventano problematici soprattutto durante lo svolgimento di studi in vitro sul meccanismo di ripigmentazione.
Sebbene sia stato dimostrato che la 1,25- diidrossivitamina D3 (VID) è altamente efficace nel trattamento della vitiligine, deve essere ancora chiarito il suo preciso meccanismo d'azione.
In questo studio è stato ottimizzato il metodo di coltura degli MPs dall'ORS dei follicoli piliferi e, inoltre, è stata studiata la capacità della VID di attivare gli MPs.
I risultati suggeriscono che gli MPs coltivati con il metodo ottimizzato hanno una morfologia principalmente bipolare, le cellule proliferano bene e non si colorano con la 3,4-diidrossi- L-fenilalanina (DOPA).
La microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato che il citoplasma degli MPs conteneva numerosi melanosomi in fase I e II; tuttavia, non sono stati osservati melanosomi in fase III o IV.
Dopo il trattamento con VID, gli MPs hanno mostrato un aumento della morfologia dendritica, le cellule si sono colorate positivamente per DOPA e sono apparsi melanosomi in stadio III e IV.
Il western blotting ha rivelato che negli MPs sono stati espressi il fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF), la tirosinasi (TYR), la proteina 1 tirosinasi correlata (TRP-1) e la TRP-2; inoltre la VID ha aumentato i livelli di espressione di MITF, TYR e TRP-1.
Tuttavia i livelli di MITF, TYR e TRP-1 negli MPs prima e dopo il trattamento con VID sono stati significativamente più bassi rispetto a quelli dei melanociti epidermici in coltura, mentre i livelli di TRP-2 in questi tre gruppi non sono stati molto diversi l'uno dall'altro.
In seguito al trattamento con VID, negli MPs è aumentata anche l'attività della TYR e i corrispondenti livelli di melanina.
In conclusione, questo studio ha ottimizzato correttamente il metodo di coltura degli MPs in modo che la sintesi di melanina e l'attività della TYR rimanessero basse; di conseguenza le culture di MP hanno espresso le caratteristiche degli MPs in vivo.
Inoltre, la VID ha determinato un forte aumento della differenziazione degli MPs.
Storia della pubblicazione:
Titolo: Optimization of the method for the culture of melanocyte precursors from hair follicles and their activation by 1,25- dihydroxyvitamin D3.
Rivista: Exp Ther Med. 2013 Oct;6(4):967-972. Epub 2013 Aug 6.
Autori: Wang D, Xu X, Ma H, Yue X, Li C, Zhu W.
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Abstract:
The melanocytes in vitiligo repigmentation are derived predominantly from melanocyte precursors (MPs) present in the outer root sheath (ORS) of hair follicles. The methods currently used for culturing MPs are unstable, and the cultured cells have the capacity to produce melanin. These factors are problematic when conducting in vitro studies to investigate the mechanism of repigmentation. Although 1,25-dihydroxyvitamin D3 (VID) has been demonstrated to be highly effective in the treatment of vitiligo in the clinic, its precise mode of action has yet to be elucidated. In the present study, the method for the culture of MPs from the ORS of hair follicles was optimized and the ability of VID to activate MPs was investigated. The results suggested that the MPs cultured using the optimized method mainly exhibited bipolar morphology. The cells proliferated well and were negative for 3,4- dihydroxy-L-phenylalanine (DOPA) staining. Transmission electron microscopy revealed that the cytoplasm of the MPs contained numerous stage I and stage II melanosomes; however, stage III and IV melanosomes were not observed. Following VID treatment, the MPs showed increased dendritic morphology, the cells stained positive for DOPA and stage III and IV melanosomes appeared in the cells. Western blotting revealed that microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase (TYR), tyrosinase- related protein-1 (TRP-1) and TRP-2 were expressed in the MPs and that VID increased the expression levels of MITF, TYR and TRP-1. However, the levels of MITF, TYR and TRP-1 in the MPs prior to and following VID treatment were significantly lower compared with those in cultured epidermal melanocytes, while the levels of TRP-2 in these three groups were not significantly different. Subsequent to VID treatment, the TYR activity in the MPs increased significantly, as did the corresponding melanin levels. In conclusion, the present study successfully optimized the method for MP culture. The MPs demonstrated no significant TYR activity or melanin synthesis; therefore, the MP cultures exhibited the features of MPs in vivo. In addition, VID significantly promoted the differentiation of MPs.
